2019-01-11
二硫键，又称S−S键，是2个巯基被氧化而形成的−S−S−形式的硫原子间的共价键，在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使之成为线状多肽链。DTT和TCEP是常用的还原二硫键的试剂，那二者在使用中有什么不同呢？
DTT中文名称为二硫代苏糖醇，是苏糖醇的C-1及C-4位羟基置换成巯基的化合物，常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。
DTT有两个巯基基团，其作用能维持3~7天，挥发性不强，使用时可以直接加入到悬滴中去，或通过微透析的方法加入。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如盐酸胍、尿素或SDS）。反之，根据DTT存在情况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。另外，DTT可以使Ni被还原，因此在用Ni柱纯化带有His标签的蛋白时要避免使用DTT，而应该考虑TECP。
二硫键的断裂通常需要有大量的自由巯基和二硫键交换，三价膦系衍生物由于其较强的还原能力和对二硫键的选择还原性得到很多研究者的青睐。这类还原剂的还原是一个定量反应的过程，其原理是其中心原子“P”所带的孤电子对能与氧原子形成配位共价结合而具有还原性。如下式所示:
TCEP，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，是三价磷系衍生物中作用最优的。它是一种无色、无味、易溶于水的弱还原性物质，在水中溶解度能达到310mg/mL。其在空气和水溶液中具有较高的稳定性，受温度和浓度的影响小。TCEP是一种极为合适的部分还原试剂，对还原二硫键选择性极强，除半胱氨酸外，几乎没有与其它氨基酸的副反应，并且能在更宽的pH值范围包括酸性条件(pH值3)下使用，从而有效减少酰胺键的水解。TCEP的反应活性温和、易溶、毒性小，且更容易操作，在酸性、碱性溶液中的稳定性都很好。而且还原能力比DTT强，它的作用可以维持2~3周，是公认的DTT(二硫代苏糖醇)的一种良好替代物。
DTT(二硫代苏糖醇)和TCEP（三(2-羰基乙基)磷盐酸盐）可以相互代替，只是效果不同而已。与DTT相比，TECP还原能力更强，更具有选择性；无论在酸性还是碱性条件下都更加稳定；本身不带有电荷，不影响后续的实验。TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉，因而在蛋白质化学及蛋白质组学研究常常优先选择TCEP。
tpp在生物体内的功能
TPP在ATP的存在下由硫胺素焦磷酸激酶催化维生素B1生成，即维生素B1的活性衍生物是焦磷酸硫胺素（TPP）。
由维生素B1在体内（如脑、肝等组织内）转变而成，是重要的酮酸如α-酮戊二酸氧化脱羧酶系的辅酶。其分子的重要特点是它的噻唑环上氮原子与硫原子之间的碳原子与通常所见的CH基团相比，表现出更强的酸性。
它可离子化生成负碳离子，后者容易接受a-酮酸或酮糖的的羰基，而带正电荷的氮原子作为一个电子库对于稳定负碳离子以及a-酮酸的脱羧作用起重要作用，由于这些酶对于糖代谢具有十分重要的作用，故与糖的分解供能过程关系密切。
由于辅酶在酶催化反应中其化学组分发生了变化，因此可以认为辅酶是一种特殊的底物或者称为“第二底物”。这种所谓的第二底物可以被许多酶所利用。例如，目前已知有约七百种酶可以利用辅酶NADH进行催化。
扩展资料：
作为一些酶的辅基而起辅因子作用。它以共价键的形式通过酰胺键和脱辅基酶蛋白的一个专一赖氨酰残基的ε- 氨基相连。ε-N-生物素酰-L-赖氨酸称为生物胞素(biocytin) (图4[生物素作为辅基的形式])。
需要生物素的酶类能催化二氧化碳的参入 (羧化作用)或转移,因而生物素和二氧化碳的固定密切相关。在羧化作用时还需要腺苷三磷酸(ATP)和镁离子的存在,此外生物素在蛋白质生物合成中以及转氨基作用中也起着重要作用。
辅酶尽管不同于酶的底物，但在作用方式上和底物类似，在酶反应过程中与酶结合、分离及反复循环。辅酶用量的确定可将它们按底物处理。例如乳酸脱氢酶中辅酶按双底物动力学方程计算。
参考资料来源：百度百科――辅酶
维生素B1（Vitamin B1，VB1） 又称硫胺素，是最早被人们提纯的水溶性维生素，化学名为氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-2-羟乙基）-4-甲基噻唑f盐酸盐，具有维持正常糖代谢的作用。
在细胞内，维生素B1的生物活性形式为硫胺素焦磷酯（thiamine pyrophosphate，TPP），TPP是丙酮酸脱氢酶复合体 （pyruvate dehydrogenase complex， PDHC）、α- 酮戊二酸脱氢酶复合体 （α-ketoglutarate dehydrogenase complex，KGDHC）和磷酸戊糖途径的转酮醇酶（tran-sketolase， TK）反应中的重要辅助因子。
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TPP在ATP的存在下由硫胺素焦磷酸激酶催化维生素B1生成，即维生素B1的活性衍生物是焦磷酸硫胺素（TPP）。
由维生素B1在体内（如脑、肝等组织内）转变而成，是重要的酮酸如α-酮戊二酸氧化脱羧酶系的辅酶。其分子的重要特点是它的噻唑环上氮原子与硫原子之间的碳原子与通常所见的CH基团相比，表现出更强的酸性，它可离子化生成负碳离子，后者容易接受a-酮酸或酮糖的的羰基，而带正电荷的氮原子作为一个电子库（election sink）对于稳定负碳离子以及a-酮酸的脱羧作用起重要作用，由于这些酶对于糖代谢具有十分重要的作用，故与糖的分解供能过程关系密切。
TPP即焦磷酸硫胺素，所含维生素为维生素B1,主要生化功能是参与a-酮酸的氧化脱羧作用。（a为 a fa 音字母）